本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种低分子量鲟鱼软骨多糖及其制备方法。本发明提供的低分子量鲟鱼软骨多糖的制备方法包括：将鲟鱼软骨经第一次酶解得到分子量大于10000Da的高分子量软骨多糖，将所述高分子量软骨多糖经过氧化氢溶液处理后，再经第二次酶解得到分子量小于5000Da的低分子量软骨多糖，所述第一次酶解使用的酶为硫酸软骨素专用提取酶，所述第二次酶解使用的酶为硫酸软骨素AC酶。该方法能够有效降低鲟鱼软骨多糖的分子量，同时显著提高其中具有抗结直肠肿瘤活性的软骨多糖的含量，制备得到的产物具有较高的抑制结直肠肿瘤细胞增殖的活性，且对于正常细胞没有毒性作用，具有开发抗肿瘤产品的潜力。