本发明提供了一种二维像素级三维定位系统及定位方法，三维定位系统包括图像采集单元、激光测距单元和控制处理单元，图像采集单元用于拍摄获取待检测工件上标记点的图像，激光测距单元用于测量平行于相机光轴方向上标记点与激光测距单元之间的距离d；控制处理单元对图像进行分析，得出标记点在像素坐标系下的坐标（u,v），并根据距离d和激光测距单元测距位置在相机坐标系下的坐标数据计算标记点到相机的深度Z_C，并基于坐标（u,v）以及Z_C计算出标记点在世界坐标系下的三维坐标。相比于现有技术，所提供的三维定位系统及定位方法，能够在二维图像的基础上，实现像素精度级别的三维定位，极大的提升了三维定位精度，且实施成本较低。