本发明公开了一种检测革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子及其制备方法，属于分析化学领域，涉及革兰氏阴性菌的分析检测和分子印迹聚合物的合成。所述分子印迹荧光纳米粒子能够特异性识别革兰氏阴性菌比如大肠杆菌O157:H7和荧光假单胞菌，并能够通过荧光信号变化进行细菌的定量分析。所述合成方法包括以下步骤：首先将模板菌液与功能单体和荧光单体预组装，然后依次加入交联剂、引发剂进行聚合反应；反应完毕后，将聚合的纳米粒子从模板上去除，即得该菌的分子印迹荧光纳米粒子。本发明采用一锅法搅拌的方式制备革兰氏阴性菌的分子印迹荧光纳米粒子，操作简单，所得分子印迹荧光纳米粒子能够特异性快速识别革兰氏阴性菌。