本发明公开了一种琼脂糖凝胶塑料基片及其制备方法与应用，其目的是提供一种表面设有凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片及其制备方法与其在制备生物芯片中的应用。该琼脂糖凝胶塑料基片，是表面设有至少2个凹槽的塑料基片，所述凹槽底部设有一层琼脂糖凝胶膜。其制备方法包括以下步骤：1)将塑料基片表面用注塑法形成凹槽；2)将塑料基片用等离子体清洗；3)向塑料基片的凹槽中注入的琼脂糖溶液，干燥后成膜；4)将凹槽处设有琼脂糖膜的塑料基片用高碘酸钠溶液进行氧化；5)将氧化后的琼脂糖塑料膜基片用水清洗，干燥，得到琼脂糖凝胶塑料基片。本发明将在生物芯片领域具有广阔的应用前景。