针对现有技术所存在的问题，本发明提供了以木质纤维素类农林废弃物为原料发酵高山被孢霉制备富含多不饱和脂肪酸的油脂的工艺。所述工艺包括预处理、糖化、高山被孢霉发酵和油脂提取等步骤。本发明中高山被孢霉的发酵阶段采用温度逐级降低的方法，可以显著提高ARA产量，降低饱和脂肪酸在油脂中的比例，ARA占总油脂比例可达48％。与现有技术相比，本发明所述工艺采用了采用基于产纤维小体细菌的纤维素酶制剂实现木质纤维素的糖化，显著降低了碳源成本和糖化阶段的用酶成本，纤维素糖化效率为80％‑90％。此外，木质纤维素糖化阶段培养基与发酵培养基可循环使用，可以显著节水和减少化学品使用，具有减少废水排放和降低成本的显著效果。