本发明提供了一种表面增强拉曼光谱基底、制备方法及应用；该制备方法先在微球自组装单层膜基底或微球自组装单层膜载玻片上，进行细蚀刻，制得细蚀刻基底；然后在细蚀刻基底上，进行第一次镀膜和第二次镀膜，制得表面增强拉曼光谱基底，该表面增强拉曼光谱基底上的相邻微球之间的间隙为5～10nm。该制备方法将原子层沉积技术用于表面增强拉曼光谱基底的制备中，结合电感耦合等离子体蚀刻法和电子束蒸镀法，该制备方法能够显著提高表面增强拉曼光谱基底的信号增强效果。该表面增强拉曼光谱基底能够应用于痕量危爆物检测中。