本发明提供一种基于亚体素卷积神经网络的超高分辨荧光显微成像方法，基于结合了多分支结构和残差学习的端到端三维亚体素卷积神经网络构建并训练得到超高分辨三维光学显微成像模型，通过该成像模型将原始光学低分辨率图像映射到三维超高分辨荧光探针的定位图像上，从而应用于三维超高分辨荧光显微成像。相较于现有的显微成像技术，该基于亚体素卷积神经网络的超高分辨荧光显微成像方法显著改善了超高分辨荧光显微成像的轴向分辨率，并且降低了三维荧光显微超分辨重建的计算复杂度。而且经网络训练成功得到的超高分辨三维光学显微成像模型即不需要额外的人工参数调节，也不需要额外的人工干预，适用于快速、灵活、三维超高分辨荧光显微成像。