本发明提供的一种多路荧光检测系统、装置及检测方法，系统沿光轴从物端到像端依次排列有激发光源、滤光片组、成像镜头组以及CMOS传感器；激发光源包括若干个波长的LED光源，滤光片组包括至少一个扇形滤光区域，扇形滤光区域的数量与LED光源的波长数量一致；激发光源用于通过LED光源输出激发光，对待检测物体进行均匀曝光，使得待检测物体激产生荧光；滤光片组用于透过目标波长荧光并截止非目标波长荧光；本申请技术方案在检测过程中通过各路LED光源，激发出待检测物体的荧光，通过滤光片扇区，截止非目标波长荧光保留目标波长荧光，方案可以通过快速切换LED通断，以实现便捷并且完成高效波长转换和荧光定量检测，可广泛应用于生物学技术领域。