本发明提供了一种考虑非线性的荧光染色薄膜厚度测量标定方法，能够有效提高荧光染色薄膜厚度的测量精度以及量程。本发明考虑激发诱导荧光成像系统中荧光强度与荧光染色薄膜厚度之间的非线性。通过使用不同标准厚度薄膜的荧光照片，基于多项式建立每个像素单元的薄膜厚度与荧光强度之间的关系式，然后构建标定系数方程组并求解，得到标定系数表。拍摄待测薄膜的荧光照片，基于标定系数表以及薄膜厚度与荧光强度之间的关系式，计算得到每一像素单元对应的薄膜厚度。可显著减小由荧光强度与荧光染色薄膜厚度之间的非线性所带来的测量误差，能有效提高荧光染色薄膜厚度的测量精度以及量程。