本发明公开了一种3D相机相对于机械臂的位姿标定方法，该方法包括：采用球形物体作为标定物，该标定球相对于机械臂基座静止不动，机械臂带动相机在不同位置对其进行拍照；根据相机获得的三维点云数据，确定标定球的球心位置；以每次拍照的球心位置相对于第一次拍照的球心位置的偏差建立目标函数，将标定问题转化为优化问题；采用指数坐标对相对位姿的姿态进行描述，采用有限差分法求解目标函数的梯度，然后采用梯度下降方法，到达目标函数的最小值，从而实现对相对位姿的标定。本发明提供的标定方法，能始终保证在标定过程中姿态矩阵是特殊正交群，有效避免了标定方法带来的误差；描述相对位姿的参数数量的最少且完备的。